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化學發(fā)光丨最具潛力的免疫學檢測方法

日期:2020-10-07

化學發(fā)光丨最具潛力的免疫學檢測方法


免疫學的檢測方法是實驗室使用最普遍的檢測方法,從凝集試驗、膠體金到ELISA,未來隨著檢測方法朝著高通量和自動化的方向發(fā)展,化學發(fā)光方法將是大勢所趨!
概要:化學發(fā)光技術(shù)壁壘高的根本原因在于:1)被檢測物質(zhì)的濃度低(μg/L—pg/L ),造成對整個檢測系統(tǒng)的精密度要求高,儀器與試劑體系封閉;2)整個檢測過程步驟多,自動化難度大;3)包含生物、化學、物理、光學等各個學科的多種前沿技術(shù),缺一不可。
國內(nèi)外主流的試劑技術(shù)類似,主流有直接化學發(fā)光(異魯米諾(新產(chǎn)業(yè))、吖啶酯(雅培))、間接(酶促)化學發(fā)光(丹納赫、邁瑞、安圖)、電化學(羅氏),各有優(yōu)劣勢,暫無明顯技術(shù)替代的趨勢,但是電化學發(fā)光被認為是第三代技術(shù),技術(shù)上略略領(lǐng)先。
試劑的性能包括準確度、靈敏度、線性范圍、抗干擾能力、存儲穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、試劑盒規(guī)格等;機器的性能包含檢測速度、試劑位、樣本位、儀器大小等,準確度是核心,通過與已獲證產(chǎn)品的對比得到;其他性能間接影響準確度,需要結(jié)合具體項目標準、廠家性能以及客戶需求綜合評價。
化學發(fā)光是干什么的?化學發(fā)光臨床廣泛應用于臨床?;瘜W發(fā)光是免疫診斷的一種,是利用抗原抗體之間的特異性反應來測定體內(nèi)疾病標志物濃度,從而判斷人體身體狀態(tài)的診斷方法,廣泛應用于傳染病、心臟疾病、腫瘤、妊娠檢測等。


免疫檢測標志物統(tǒng)計超過100個,按照免疫反應中的角色,標志物可以分為抗體與抗原,其中抗原又包括大分子抗原與小分子抗原。


化學發(fā)光的原理免疫反應??乖M入機體,刺激機體的免疫系統(tǒng),使之產(chǎn)生免疫應答,這種反應叫免疫反應。免疫反應應答包括對抗原物質(zhì)的感應、反應、效應三個連續(xù)的階段。免疫分析(immunoassay,IA)。在臨床檢驗中,基于抗原與其配對抗體能夠發(fā)生特異反應,用已知的抗原或抗體檢測分析體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。高特異性??乖贵w的結(jié)合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間。由于兩者在化學結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系,所以抗原抗體反應具有高度的特異性??乖贵w反應的高特異性是免疫學檢測的基礎。高親和性。抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態(tài)平衡,其反應式為:Ag+Ab→Ag·Ab。高親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合,兩者結(jié)合牢固,不易解離。
免疫分析技術(shù)的發(fā)展:美國臨床化學會議規(guī)定:凡是通過測量光子計數(shù)的方法都是化學發(fā)光。與酶聯(lián)免疫相比化學發(fā)光的進步點:1.全程自動化——機械與自動化;2.定量技術(shù)的優(yōu)化:利用化學發(fā)光發(fā)光,精確計算光子數(shù)——光學;3.磁性顆粒的應用——材料;4.抗體標記技術(shù)的進步——生物化學。

免疫診斷五大方法對比:化學發(fā)光是趨勢與其他免疫診斷方法相比,化學發(fā)光由于其在安全性、自動化操作、測試準確性、以及測試速度等方面的系統(tǒng)性優(yōu)勢,在性能上對其他技術(shù)形成全面超越,因此成為免疫診斷的主流。


化學發(fā)光步驟繁多。化學發(fā)光原理解析:以酶促法(一步法)為例

根據(jù)沖洗次數(shù),可以分為一步法、兩步法、三步法等、四步法;
各個組分的量在5~200uL級別;所有過程均需要在特定溫度中進行;樣本中與被檢測檢測抗原/抗體結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)會對結(jié)果產(chǎn)生較大影響;


磁微粒標記-分離技術(shù)

?磁微粒指的是nm級別的磁性顆粒,表面帶有活性基團;

磁微??梢岳帽砻娴幕钚曰鶊F與抗體、抗原、鏈霉親和素連接;

伴隨著磁微粒技術(shù)的發(fā)展,板式發(fā)光已基本被替代。

?

磁微粒分離技術(shù)特點:

?較微孔板擴大抗原抗體結(jié)合表面積,增加抗原或抗體的結(jié)合量,提高檢測靈敏度。

?加快反應速度,迅速捕獲抗原抗體。

?易于結(jié)合相、游離相的分離,提高檢測準確性

酶標記技術(shù)、溯源以及試劑盒的開發(fā)難點酶標記技術(shù)?抗體/抗原表面具有多個活化基團(氨基/羧基),通過這些基團連接酶與抗體稱為酶標記;?酶標記分為大分子與大分子標記、大分子與小分子標記;?交聯(lián)程度的小大對試劑盒性能起重要影響。試劑盒的開發(fā)?變量多:抗體對的配對、“磁珠”與“酶標”的稀釋度、合適的“配方”溶液、其他的試劑盒組分、孵育時間檢測結(jié)果溯源?將開發(fā)的試劑盒檢測結(jié)果與對照結(jié)果建立相關(guān)的關(guān)系?標準品的穩(wěn)定性是難點?不同的廠家檢測結(jié)果的絕對值可能不同

主流的化學發(fā)光技術(shù)各有千秋化學發(fā)光的基本原理:由于化學反應(通常是氧化)底物從基態(tài)躍遷為激發(fā)態(tài),激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時,躍遷能量以光子形式釋放的現(xiàn)象。
吖啶酯、ALP以及HRP發(fā)光系統(tǒng)的原理電化學發(fā)光原理各個系統(tǒng)優(yōu)劣勢比較
主流的5大發(fā)光技術(shù)各有優(yōu)缺點??綜合來看,主流的5大發(fā)光技術(shù)各有優(yōu)缺點,不能說技術(shù)誰優(yōu)誰劣,但是從市場來看,Roche的電化學發(fā)光技術(shù)市場認可度稍稍領(lǐng)先;?從國外四大家的優(yōu)勢項目對比來看,Roche(電化學)在腫瘤項目上占優(yōu),雅培(吖啶酯)在傳染病項目上占優(yōu),而丹納赫(ALP)在甲功激素項目上占優(yōu),也可以看出代表各個國外龍頭廠家代表的技術(shù)無法占據(jù)絕對優(yōu)勢;?相對于不同技術(shù)種類的差異,國內(nèi)廠家對產(chǎn)品研發(fā)、質(zhì)量控制能力更為重要。
化學發(fā)光試劑的性能評價與比較:?準確度是評價試劑性能的主要指標,一切指標都體現(xiàn)在測試是否準確,但是由于各個標志物均有一定的特異性,客戶無法根據(jù)某一次結(jié)果的正確與否對該廠家的產(chǎn)品做出評價——化學發(fā)光的結(jié)果只能作為參考,不能作為金標準;?國內(nèi)廠家結(jié)果的準確度根據(jù)與國外廠家的對比結(jié)果來判斷,線性系數(shù)R2、顯著性水平等是重要的指標;?除了準確度以外,試劑的靈敏度、重復性、線性范圍、抗干擾能力、存儲穩(wěn)定性、開機穩(wěn)定性、試劑盒的包裝量等20多個參數(shù)均為試劑盒的評價指標。除了儀器與試劑性能的對比,裝機量、單機使用量、項目總數(shù)量、項目發(fā)布、三甲醫(yī)院使用率等數(shù)據(jù)對評價廠家的產(chǎn)品同樣重要,需要綜合評價。
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