假陰性問題沒那么簡(jiǎn)單

國(guó)家衛(wèi)建委：結(jié)果陰性也可能感染

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2月21日，國(guó)家衛(wèi)健委印發(fā)《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第五版）》，在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南中明確指出，核酸檢測(cè)結(jié)果陰性不能排除新冠病毒感染，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的因素。

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具體因素包括：樣本質(zhì)量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確保存、運(yùn)輸和處理樣本；技術(shù)本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。

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近日在廣東省人民政府新聞辦公室舉行發(fā)布會(huì)上，國(guó)家衛(wèi)健委高級(jí)別專家組組長(zhǎng)、中國(guó)工程院院士鐘南山也表示，用核酸檢測(cè)確診是正確的，但還要看取材，絕大多數(shù)采樣是取鼻和咽，如果采樣不準(zhǔn)確，會(huì)造成很大的結(jié)果差異。

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同時(shí)鐘南山還表示，核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性并沒有媒體說的那么低。之前有媒體報(bào)道稱，核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確率只有30%-50%左右，有的甚至說只有20%-30%，其實(shí)核酸檢測(cè)應(yīng)該是比較準(zhǔn)確的。

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核酸檢測(cè)準(zhǔn)確率不會(huì)這么低，但國(guó)內(nèi)也確有患者檢測(cè)4次都是陰性，第5次才是陽(yáng)性的情況。

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2月8日，浙江青田縣新型冠狀病毒感染的肺炎疫情防控工作指揮部發(fā)布公告稱，51歲男性患者章某某，2月1日起連續(xù)4次核酸檢測(cè)均為陰性，2月7日第5次核酸檢測(cè)呈陽(yáng)性，確診為新型冠狀病毒感染的肺炎病例。

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1月30日《人民日?qǐng)?bào)》報(bào)道，天津一例新型冠狀病毒患者在1月25日、1月28日共進(jìn)行3次核酸檢測(cè)，都為陰性，但是在1月30日的第四次檢測(cè)中呈陽(yáng)性。

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檢測(cè)四五次才能確診，這些真的是因?yàn)樾滦凸跔畈《咎苹珕幔?/span>

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核酸檢測(cè)是金標(biāo)準(zhǔn)，沒有疑問

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想知道為什么出現(xiàn)假陰性，就要知道核酸檢測(cè)試劑盒如何檢測(cè)新冠病毒。

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根據(jù)國(guó)家衛(wèi)健委臨床檢驗(yàn)中心介紹，新型冠狀病毒與2003年的SARS冠狀病毒一樣，由RNA核酸和蛋白等組成。RNA核酸由四種不同堿基排列而成，不同病毒的核酸堿基排列方式，就像發(fā)報(bào)的密電碼，各有不同。

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因此可以通過采集人的特定部位細(xì)胞樣本，檢測(cè)其中是否含有病毒RNA核酸，確認(rèn)機(jī)體是否受到感染。

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核酸檢測(cè)就像分析密電碼，新型冠狀病毒也有其特異的密電碼，但與其它冠狀病毒也有相似性，根據(jù)2月19日國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》，目前研究顯示，新型冠狀病毒與蝙蝠SARS樣冠狀病毒同源性達(dá)85%以上。

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新型冠狀病毒的RNA核酸約有3萬個(gè)堿基，不同區(qū)域和其它冠狀病毒的相似性有所不同，有些區(qū)域相似度高達(dá)90%以上，因此核酸檢測(cè)試劑選擇相似度低的區(qū)域進(jìn)行，這樣就可以特異地識(shí)別新型冠狀病毒。

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就像同一地區(qū)身份證號(hào)有幾位數(shù)字相同，那么就通過其他區(qū)域的數(shù)字對(duì)個(gè)人進(jìn)行區(qū)分。

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進(jìn)行區(qū)域識(shí)別后，如果核酸檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即證明新冠病毒特有的RNA核酸存在，即感染新冠病毒。通常我們說病毒核酸檢測(cè)是確診感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，這個(gè)“金標(biāo)準(zhǔn)”就是指“陽(yáng)性”結(jié)果。

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近期有部分一線醫(yī)生和業(yè)內(nèi)人士建議將CT也作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，但嚴(yán)格來講，CT的準(zhǔn)確性比不上核酸檢驗(yàn)，更無法替代核酸檢測(cè)。

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近日中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)主任委員王成彬發(fā)布文章表示，核酸檢測(cè)從方法學(xué)層面考慮其作為實(shí)驗(yàn)室診斷金標(biāo)準(zhǔn)沒有任何疑問。

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CT作為臨床影像學(xué)篩查指標(biāo)具有重要價(jià)值，但無論從早期診斷、鑒別診斷、排除診斷還是最終確診等方面都還具有一定的局限性，更無法替代病原學(xué)診斷。

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假陰性的四方面原因

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對(duì)核酸檢驗(yàn)假陰性，不少聲音將原因指向核酸檢測(cè)試劑盒，但實(shí)際上核酸檢測(cè)是一個(gè)流程，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都有可能導(dǎo)致假陰性。

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根據(jù)國(guó)家衛(wèi)健委臨床檢驗(yàn)中心信息，在被感染者中檢出核酸，需同時(shí)滿足以下四個(gè)條件：

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（1）被感染者的細(xì)胞中有一定量的病毒；

（2）采集標(biāo)本時(shí)，必須采集到含有病毒的細(xì)胞；

（3）可靠的體外診斷試劑；

（4） 規(guī)范的臨床核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室（合理的分區(qū)、有能力的檢測(cè)人員和嚴(yán)格的質(zhì)量管理體系）。

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以上4個(gè)條件就是可能導(dǎo)致假陰性的4方面因素。

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患者：可能病毒含量太少

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核算檢測(cè)試劑對(duì)感染者體內(nèi)的病毒存在量有一定要求，如果病毒含量太少，現(xiàn)有的方法或許檢測(cè)不到。

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據(jù)了解，新冠肺炎患者的發(fā)病都會(huì)經(jīng)歷一個(gè)從感染后無癥狀，到輕度癥狀出現(xiàn)，再到嚴(yán)重癥狀出現(xiàn)的過程。

不同病程、不同病情患者機(jī)體中的病毒存在量可能不同，已有病毒感染，但由于在相關(guān)部位采集不到病毒或采集到的病毒量太少，以致于現(xiàn)有方法檢測(cè)不到，也稱窗口期。

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王成彬表示，對(duì)臨床高度疑似新冠肺炎患者，應(yīng)該連續(xù)采集標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，這可能是臨床患者多次檢測(cè)陰性，陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)晚的主要原因之一。

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其實(shí)任何病原學(xué)檢測(cè)，都不能只根據(jù)一次陰性結(jié)果而做出排除性診斷，更不能根據(jù)核酸檢測(cè)陰性而漏診臨床高度疑似的新冠肺炎患者，尤其在高發(fā)地區(qū)，在大面積流行期間。

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此外，患者不同部位的病毒存量也不一樣。

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機(jī)體被病毒感染后，病毒通過鼻腔和口腔進(jìn)入到咽喉部，再到氣管和支氣管，進(jìn)而到達(dá)肺泡，不同病程階段以及機(jī)體不同部位存在的病毒量有所不同，由這些部位細(xì)胞所含病毒受體占比不同所致。

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新型冠狀病毒感染，肺泡上皮細(xì)胞的病毒受體表達(dá)占比最高，氣道上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等則占比極低。

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因此，下呼吸道的病毒量明顯高于上呼吸道，呼吸道病毒檢出可能性又高于血液。肺泡灌洗液中最容易檢出病毒核酸，其次是深咳痰，再是鼻咽部，再次是口咽部。

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但是采集肺泡灌洗液的標(biāo)本卻沒有那么簡(jiǎn)單。

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標(biāo)本：假陰性無法完全避免

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根據(jù)王成彬表述，很多專家從實(shí)踐工作中總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液標(biāo)本陽(yáng)性率高于上呼吸道的口鼻咽拭子采集的標(biāo)本；鼻咽拭子標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率又高于口咽拭子。

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口鼻咽拭子這也是這兩天被廣泛評(píng)論的某患者咽拭子標(biāo)本三次核酸檢測(cè)陰性，收住院后在搶救過程中采集肺泡灌洗液標(biāo)本核酸檢測(cè)陽(yáng)性的原因。

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雖然肺泡灌洗液的陽(yáng)性率最高，但是操作復(fù)雜，采集難度大，而且容易引起患者噴射，導(dǎo)致采集操作者感染風(fēng)險(xiǎn)大，因此難以作為常規(guī)采樣方法，只有部分氣管切開、上呼吸機(jī)搶救病人可用。

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此外根據(jù)國(guó)家衛(wèi)健委檢驗(yàn)中心信息，新冠肺炎患者通常為干咳，下呼吸道的痰標(biāo)本也較難得到。

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由于操作的方便性和患者的接受程度，目前臨床最常用的標(biāo)本是口咽部拭子，其次是鼻咽部拭子。

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因此，采集部位不當(dāng)，如采集口咽拭子時(shí)，采集深度不夠；采集鼻咽拭子沒有采到鼻腔深處等，采集到的細(xì)胞可能大部分都不含病毒，即可能造成假陰性。

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此外，如果平時(shí)醫(yī)護(hù)人員咽拭子取樣不多，刮取標(biāo)本時(shí)患者的反應(yīng)又比較大，往往導(dǎo)致刮取標(biāo)本的位置不對(duì)，或力度和時(shí)間不夠，沒有刮取到帶病毒的標(biāo)本或刮取到的帶病毒標(biāo)本量少，最后也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果陰性。

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對(duì)比國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的第四版、第五版和第六版診療方案可以發(fā)現(xiàn)，第五版已經(jīng)將第四版的“咽拭子”改為“鼻咽拭子”。

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第六版又添加內(nèi)容強(qiáng)調(diào)：為提高核酸檢測(cè)陽(yáng)性率，建議盡可能留取痰液，實(shí)施氣管插管患者采集下呼吸道分泌物，標(biāo)本采集后盡快送檢。

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采集患者標(biāo)本的重點(diǎn)已經(jīng)越來越偏向下呼吸道，檢驗(yàn)的陽(yáng)性率或許也將明顯提高。

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實(shí)際上，在樣本中尋找病毒，就像在一本百萬字的書里尋找錯(cuò)別字，理論上說，即使只有一個(gè)錯(cuò)別字也可以被發(fā)現(xiàn)。

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但實(shí)際上，由于成本和時(shí)間等的限制，只能從中隨機(jī)抽取10萬或者20萬字進(jìn)行查找，如果錯(cuò)別字?jǐn)?shù)較少，就有可能不在被抽取的字?jǐn)?shù)當(dāng)中，因此無法找到。

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同樣，樣本中病毒數(shù)量低于一定程度，試劑也就無法檢出。因此從這個(gè)層面上看，病毒核酸檢測(cè)的“假陰性”或許是無法完全避免的。

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檢測(cè)試劑：火速獲批，質(zhì)量或參差不齊

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疫情面前，檢測(cè)試劑獲批十分迅速。

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1月26日國(guó)家藥監(jiān)局發(fā)布消息表示，已應(yīng)急審批通過4家企業(yè)4個(gè)新型冠狀病毒檢測(cè)產(chǎn)品，包括華大基因新型冠狀病毒檢測(cè)試劑盒、華大智造DNBSEQ-T7測(cè)序系統(tǒng)獲批、上海捷諾rtpcr、上海之江rtpcr。

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據(jù)了解，國(guó)家藥監(jiān)局啟動(dòng)應(yīng)急審批程序，僅4天就批準(zhǔn)四家公司四個(gè)產(chǎn)品，緊急應(yīng)對(duì)疫情。目前已有多家械企完成新冠病毒檢測(cè)試劑的研發(fā)或者獲得注冊(cè)證。

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根據(jù)上市公司公告，達(dá)安基因已獲得新型冠狀病毒（2019-nCoV)核酸檢測(cè)試劑盒（熒光 PCR法）的醫(yī)療器械注冊(cè)證。

迪安診斷、萬孚生物、美康生物、透景生命等械企都已完成新型冠狀病毒（2019-nCoV）系列檢測(cè)試劑新品的研發(fā)，部分已進(jìn)入應(yīng)急審批通道。

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據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前有超過130家企業(yè)在生產(chǎn)新型冠狀病毒相關(guān)檢測(cè)試劑。

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對(duì)于這些檢測(cè)試劑的質(zhì)量，近日重慶市人民醫(yī)院三院院區(qū)檢驗(yàn)科發(fā)布《6 種國(guó)產(chǎn)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑檢測(cè)性能比較與分析》（下稱《比較與分析》）。

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上述檢驗(yàn)科醫(yī)務(wù)人員收集院內(nèi)1 例弱陽(yáng)性患者不同時(shí)間點(diǎn)采集的咽拭子標(biāo)本。因?yàn)槿蹶?yáng)性樣品往往對(duì)試劑盒的靈敏度有較高要求，如果最低檢出限達(dá)不到樣品的檢測(cè)濃度，則會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

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根據(jù)《比較與分析》，試驗(yàn)具體選取了圣湘生物、北京卡尤迪、碩世生物、中元生物、中山達(dá)安和北京卓成惠生的新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒，基因檢測(cè)類型均為 ORF1ab 和 N 基因兩個(gè)靶點(diǎn)。

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最終研究結(jié)果表明，國(guó)產(chǎn) 6 種試劑對(duì)弱陽(yáng)性樣品的檢測(cè)能力參差不齊，少數(shù)試劑對(duì)兩個(gè)基因靶點(diǎn)均能檢出，而部分試劑只能檢測(cè)出其中一個(gè)。

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從試劑方面分析原因，可能與試劑引物設(shè)計(jì)有關(guān)，也可能與各位點(diǎn)檢測(cè)靈敏度相關(guān)。

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某知名診斷械企相關(guān)負(fù)責(zé)人對(duì)賽柏藍(lán)器械表示，檢測(cè)試劑靈敏度是個(gè)重要因素，因?yàn)镈NA比RNA穩(wěn)定，所以要先把RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，到一定濃度后，通過試劑中的引物和探針對(duì)相應(yīng)基因靶點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

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每個(gè)廠家試劑中引物和探針的靈敏度都有區(qū)別，濃度、純化程度以及試劑中酶、金屬離子等成分與質(zhì)量的差異，都可能影響擴(kuò)增效率和最后檢測(cè)結(jié)果的靈敏度。

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王成彬分析稱，由于本次疫情的特殊和緊迫性，很多廠家研發(fā)試劑來不及完成正常流程，無法得到一定數(shù)量臨床患者標(biāo)本的驗(yàn)證，只能通過模擬真實(shí)標(biāo)本中的病毒進(jìn)行驗(yàn)證。

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國(guó)家衛(wèi)健委臨床檢驗(yàn)中心也表示，部分廠家的試劑產(chǎn)品由于研發(fā)時(shí)間短，也沒有使用已知臨床樣本進(jìn)行必要的性能確認(rèn)，可能存在對(duì)試劑優(yōu)化不充分以及試劑批間差異大等問題。

實(shí)驗(yàn)室：30家機(jī)構(gòu)，符合率100%

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除了檢測(cè)試劑本身，實(shí)驗(yàn)室規(guī)范與否也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生重要影響。標(biāo)本運(yùn)輸保存條件、臨床實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范操作、結(jié)果判讀和質(zhì)量控制等都是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的關(guān)鍵因素。

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那么我國(guó)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力如何？

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近日根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)消息，貴州省臨床檢驗(yàn)中心組織了針對(duì)省內(nèi)34家新型冠狀病毒核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行技術(shù)考核，考核品一共分10個(gè)批次，包括陰性、弱陽(yáng)性和陽(yáng)性。

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最終結(jié)果顯示，考核發(fā)放樣品34家，至規(guī)定時(shí)間回收結(jié)果30份。在30家檢測(cè)機(jī)構(gòu)，總符合率為100%。

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其中陽(yáng)性樣品符合率、陰性樣品符合率、全省疾控系統(tǒng)總符合率、全省醫(yī)療機(jī)構(gòu)總符合率、第三方機(jī)構(gòu)總符合率均為100%。本次考核，一共涉及6個(gè)廠家試劑，其符合率也為100%。

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貴州省臨床試驗(yàn)中心表示，在回報(bào)的30家檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中，用于考核樣品檢測(cè)的一共為6家產(chǎn)品，并且主要集中在傳統(tǒng)的2家基因試劑廠家上，占87%左右。

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貴州省臨床試驗(yàn)中心認(rèn)為，對(duì)于社會(huì)關(guān)注的核酸檢測(cè)陽(yáng)性率低的問題，主要是由病人疾病發(fā)展過程、標(biāo)本采集、標(biāo)本保存與運(yùn)輸?shù)葐栴}引起。加強(qiáng)與臨床和疾控采樣人員的溝通和聯(lián)系，共同對(duì)分析前質(zhì)量進(jìn)行管理，以保障檢驗(yàn)質(zhì)量，其意義非常重要。

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據(jù)了解，2月21日國(guó)家衛(wèi)健委印發(fā)的《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第五版）》，同時(shí)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南》對(duì)標(biāo)本采集、處理、包裝、保存、送檢、檢測(cè)以及等實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)提出詳細(xì)要求。

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例如采集咽拭子時(shí)，要求被采集人員頭部微仰，嘴張大，并發(fā)“啊”音，露出兩側(cè)咽扁桃體，將拭子越過舌根，在被采集者兩側(cè)咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次進(jìn)行采集。

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以此規(guī)范標(biāo)本采集等流程操作，盡量避免影響檢驗(yàn)結(jié)果。

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抗體檢測(cè)輔助，降低假陰性率

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綜上所述，核酸檢驗(yàn)的假陰性有多方面因素，如標(biāo)本中尋找病毒有概率性、不可能所有醫(yī)護(hù)人員都操作規(guī)范等，類似這樣的問題一時(shí)難以解決，但并不代表沒有其他辦法有效降低假陰性的概率。

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2月15日據(jù)央視新聞報(bào)道，在鐘南山院士的指導(dǎo)下，實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合多家研究機(jī)構(gòu)，最新研發(fā)出新型冠狀病毒IgM抗體快速檢測(cè)試劑盒，并已在實(shí)驗(yàn)室和臨床完成初步評(píng)價(jià)。

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據(jù)介紹，此試劑盒僅需采取一滴血就可在15分鐘內(nèi)肉眼觀察獲得檢測(cè)結(jié)果，且患者的血漿稀釋500至1000倍后，仍能檢測(cè)出陽(yáng)性條帶。

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國(guó)家衛(wèi)健委臨床檢驗(yàn)中心表示，補(bǔ)充新型冠狀病毒特異抗體檢測(cè)，這一辦法對(duì)降低假陰性率行之有效。

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據(jù)國(guó)家藥監(jiān)局器審中心官微介紹，特異性抗體檢測(cè)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過抗原檢測(cè)抗體的存在，間接證明人體已感染或曾感染新型冠狀病毒。

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據(jù)了解，檢測(cè)的抗體主要分為IgM和IgG兩類。一般IgM抗體在感染早期出現(xiàn)，IgG抗體在感染中晚期出現(xiàn)，滴度有一個(gè)持續(xù)增高的過程，并在血液循環(huán)中保持較長(zhǎng)時(shí)間存在。

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但是要注意，雖然抗體檢測(cè)能在一定程度上證明人體感染病毒，但并不能取代核酸檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)地位。

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國(guó)家衛(wèi)健委臨床檢驗(yàn)中心強(qiáng)調(diào)，檢測(cè)特異抗體也可以明確患者是否“近期或既往感染過新型冠狀病毒”，有助于核酸檢測(cè)陰性但臨床上疑似患者的確診。

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但是特異抗體檢測(cè)陽(yáng)性不能像病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性一樣作為病毒感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，因?yàn)榭贵w檢測(cè)容易受到血液標(biāo)本中的一些干擾物質(zhì)，如類風(fēng)濕因子、非特異IgM、溶血所致的高濃度血紅蛋白等的存在而出現(xiàn)“假陽(yáng)性”結(jié)果。

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與此同時(shí)，已有械企完成研發(fā)或取得相關(guān)產(chǎn)品的注冊(cè)證。

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2月21日，安圖生物發(fā)布公告稱，近日已取得抗體檢測(cè)試劑盒的《醫(yī)療器械注冊(cè)證》，具體包括肺炎支原體 IgG 抗體檢測(cè)試劑盒、呼吸道合胞病毒IgM 抗體檢測(cè)試劑盒、腸 道 病毒 71 型IgM 抗體檢測(cè)試劑盒。

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2月20日，萬孚生物發(fā)布公告稱，公司收到國(guó)務(wù)院通知，申報(bào)的適宜于疫情現(xiàn)場(chǎng)的新型冠狀病毒抗原快速檢測(cè)試劑、基于熒光微球/膠體金免疫層析技術(shù)新型冠狀病毒抗體快速檢測(cè)試劑，二個(gè)項(xiàng)目的產(chǎn)品推薦進(jìn)入應(yīng)急審批通道。

2月21日，邁克生物發(fā)布公告稱，目前公司已完成新型冠狀病毒 IgG 和 IgM 抗體檢測(cè)試劑盒（直接化學(xué)發(fā)光法）、新型冠狀病毒（SARS-Cov-2）IgG/IgM 抗體檢測(cè)試劑盒（膠體金法）的研發(fā)工作。